ALL SEQ-DNA Protein Interactions(四)

1.PB_seq

蛋白質/ DNA結合后跟隨高通量測序

PB_seq是一種DNA結合分析，可以在沒有染色質的情況下在全基因組范圍內表征DNA蛋白結合能量景觀?（Guertin等，2012）。它屬于通常通過指數(shù)富集（SELEX）系統(tǒng)進化配體的方法家族?（Ozer等，2014）。對基因組DNA進行超聲處理，大小選擇和純化。在與DNA結合蛋白雜交后，分離，提取蛋白質結合的DNA并制備用于測序。

好處：

確定與染色質結構無關的結合效率

缺點：

尚未被科學界廣泛采用

2.Pu-seq

聚合酶使用測序

Pu-seq提供直接的復制起源位置和效率數(shù)據(jù)，以及復制時間的間接估計?（Daigaku等，2015）。

含有雙鏈核糖核苷酸的DNA的堿處理導致磷酸骨架對核糖的裂解3'，產生5'羥基末端。如果變性DNA用作隨機六聚體引物延伸的模板，則5ê至3ê合成導致鄰近初始核糖的齊平末端。通過從單鏈DNA產生文庫并在每個末端放置不同的索引引物，可以將測序讀數(shù)定位到單個鏈，以確定具有單堿基準確度的原始核糖核苷酸位置。

好處：

單基準確度

缺點：

僅適用于酵母

3.SELEX or SELEX-seq / HT-SELEX

通過指數(shù)富集的指數(shù)富集/高通量配體系統(tǒng)演化的配體的系統(tǒng)演化

自1990年3個獨立小組描述第一次SELEX實驗時?（Ellington等，1990）?（Tuerk等，1990）（Sullenger等，1990），該方法適用于廣泛的范圍技術?（Chen et al。，2016）?（Takahashi et al。，2016）。為NGS開發(fā)了一種高度多路復用的并行HT-SELEX方法?（Jolma等，2010）。SELEX-seq的變體?（Slattery等，2011）?使用Nextera銜接子序列進行有效的文庫制備?（Zhang等，2016）。

在該方法中，蛋白質表達為與pD40htSELEX表達載體中與高斯熒光素酶綴合的鏈霉抗生物素蛋白結合肽（SBP）的融合體。每個DNA配體含有14bp隨機區(qū)域（14N）和5bp條形碼，其單一地識別單個SELEX樣品。部分嵌套的引物用于連續(xù)的SELEX輪次。將含有所有可能的14bp序列的雙鏈DNA混合物與固定在96孔板的孔中的DNA結合蛋白一起溫育，導致DNA與蛋白質結合。洗滌和洗脫后，通過PCR擴增得到的更具特異性序列的群體并測序?（Caroli等，2016）

好處：

高通量和高效率

軟件管道可用?（Hoinka等，2016）（Caroli等，2016）

缺點：

可能包含序列偏差

4.HITS-FLIP

采用熒光配體相互作用分析的高通量測序

HiTS-FLIP是一種在前所未有的深度測量定量蛋白質-DNA結合親和力的技術。在該方法中，內置于高通量測序儀中的光學器件用于可視化蛋白質與流動細胞中測序的DNA的體外結合?（Nutiu等人，2011）。

通過合成對具有錨定的單鏈DNA的微流體流動細胞進行測序。剝離第二鏈DNA并使用Klenow聚合酶和未修飾的dNTP重建以形成雙鏈DNA簇。以不同濃度引入熒光標記的結合蛋白，并對結合進行成像。

好處：

量化和全面

缺點：

需要專門的硬件

尚未被科學界廣泛采用